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　　BUNSEN本生小課堂：elisa實驗樣本的收集匯總
 

　　一般來說，由于ELISA實驗只能檢測可溶性蛋白質(zhì)的含量，因此要求樣本應(yīng)清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì)。為確保實驗的準確性， -20℃或-80℃保存的樣本應(yīng)在1-6個月內(nèi)完成檢測，4℃保存的樣本在一周內(nèi)完成檢測。此外，樣本中不能含有會抑制HRP活性的NaN3，否則會造成假陰性結(jié)果。

　　可用于ELISA實驗的樣本一般有血清、血漿、尿液、細胞培養(yǎng)上清以及組織勻漿等。不同樣本類型的預(yù)處理方法也不同。適當?shù)臉颖绢A(yù)處理是確保ELISA實驗正確性和準確性的第一步。這里，我們將介紹幾種不同樣本類型的處理方法。

　　液體樣本處理原則：所有的液體樣本，用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)

　　1、血清

　　血清是ELISA實驗常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡單。使用無熱原無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室內(nèi)溫度下放置自然凝固(視室溫環(huán)境10分鐘到2小時不等)或4℃過夜，分離出血清，(建議傾斜試管或離心管以擴大液面的橫截面，使血清能更大程度的分離出來，)，2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)，仔細收集上清，立即進行測定，建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

　　注意事項：在收集血液樣本的過程中應(yīng)避免溶血，因為紅細胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA實驗中將會出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另外，樣本還應(yīng)避免細菌污染，因為細菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。

　　2、血漿

　　應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA、肝素鈉、枸櫞酸納或檸檬酸鈉作為抗凝劑，使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內(nèi)，混合10-20分鐘后，2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)，仔細收集上清液(血漿)，建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。保存過程中如有沉淀形成，使用前應(yīng)該再次離心。

　　注意事項：檢測前請仔細閱讀ELISA試劑盒說明書，查看該試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。
 

　　3、尿液

　　用無菌管收集，2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

　　4、細胞培養(yǎng)上清

　　檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。將細胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中并以2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)，除去細胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融，保存過程中如有沉淀形成，使用前應(yīng)再次離心。

　　固體樣本處理原則：稱取1g的固體樣本，用9ml的合適緩沖液溶解，分泌蛋白可以直接離心取上清檢測，細胞內(nèi)的蛋白，要先收集細胞，再用合適方法破碎，離心取上清測試。

　　1、組織標本

　　切割標本后，稱取1g組織，加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)，仔細收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，使用前應(yīng)再次離心。對于植物組織，不好勻漿的話，就在液氮中充分研磨。

　　2、細胞內(nèi)蛋白樣本

　　許多待測蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細胞內(nèi)的蛋白，這個時候，要先收集細胞，洗滌干凈，再破碎細胞，離心取上清。

　　2-1、培養(yǎng)的細胞

　　A、動物細胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融(如果反復(fù)凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎)，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)，仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，使用前應(yīng)再次離心。

　　B、植物細胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到100萬/ml左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設(shè)置破碎2s，冷卻30s的方式，充分破碎細胞，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)，仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，使用前應(yīng)再次離心。

　　2-2、組織的細胞

　　切割標本后，稱取1g組織，加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)，去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細胞三遍。再用上述的細胞破碎方法破碎細胞。

　　細胞反復(fù)凍融方法

　　1) 吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細胞沖洗干凈。懸浮細胞可以省略該步驟。

　　2) 將細胞懸浮液收集到離心管中，以1000×g離心10分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細胞3次。

　　3) 加入適量的預(yù)冷PBS(建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑)重懸細胞。在6孔培養(yǎng)板中，每個孔需要150-250μL的PBS來重懸細胞。

　　4) 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過程數(shù)次，直至細胞裂解。也可以使用超聲波細胞破碎器超聲處理懸浮液來裂解細胞。

　　5) 4℃下以10,000×g離心10分鐘，去除細胞碎片，收集上清液， -20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

　　3、土壤

　　稱取1g土壤，加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工將標本充分混勻。2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)，仔細收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測分泌蛋白，直接取上清檢測，測試細胞內(nèi)蛋白，要破碎細胞。

　　注：以上供參考！

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